分子生物学 第 5 章 第 4 节：蛋白质及 RNA 相互作用技术
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5.4.1 酵母单杂交系统
- yeast one-hybrid system
- 可识别稳定结合于 DNA 上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核生物中 DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选 DNA 文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因
- 基本原理：
- 将已知的特定顺式作用元件构建到最基本密码子 （minimal promoter，Pmin） 的上游，把报告基因连接到 $P_{min}$ 下游
- 将编码待测转录因子 cDNA 与已知酵母转录激活结构域AD融合表达载体导入酵母细胞
- 该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活 $P_{min}$ 启动子，使报告基因得到表达
- 应用：确定某个 DNA 分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用，用于分离编码结合于特定顺式作用元件或其他 DNA 位点的功能蛋白编码基因，验证转录因子的 DNA 结合结构域，准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列
5.4.2 酵母双杂交系统
- yeast two-hybrid system
- 一种利用酵母在体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的系统
- 转录因子 = DNA 结合结构域BD + 转录激活结构域AD
5.4.3 蛋白质相互作用技术
① 等离子表面共振SPR技术
- 蛋白质相互作用 → 共振角度改变
- 蛋白质浓度 $\propto$ 共振角度改变
② 免疫共沉淀技术 （co-immuno precipitation，CoIP）
- 蛋白质相互作用 → 复合物沉淀
③ GST 及 GAD 融合蛋白沉降技术
- 体外实验
- GST：谷胱甘肽 S-转移酶（一种标签）
- GAD：谷氨酸脱羧酶
- 该技术利用 GST 对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球株的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白
- 应用：
- 确定探针蛋白与未知蛋白间的相互作用
- 确证探针蛋白与某个已知蛋白质之间的相互作用
④ 荧光共振能量转移FRET
- 体内实验
- 检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用
5.4.4 染色质免疫共沉淀技术
- chromatin immuno precipitation，ChIP
- 实验步骤：
- 在活细胞状态下固定蛋白质-DNA 复合物，并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度的染色质小片段
- 通过抗原抗体特异性识别反应，沉淀该复合物，从而富集与目的蛋白相结合的 DNA 片段
- 对目的片段进行纯化和测序分析，就能获知与目的蛋白发生相互作用的 DNA 序列信息（包括 DNA 序列特征、在基因组上的位置、结合强度、对基因表达的影响等）
5.4.5 RNAi
- RNA interfering
- 利用 siRNA 高效、特异性地降解细胞内同源 mRNA，从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型