微生物学 章节五：微生物的营养与生长

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5.1 六大营养因素

1. 碳源
2. 氮源
   • 实验室常用的无机氮源：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏
   • 生产上常用的氮源：硝酸盐、铵盐、尿素、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆
   • 速效氮源： 无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用，这种氮源叫做速效氮源
   • 迟效氮源： 蛋白氮必须通过水解之后降解成胨、肽、氨基酸等才能被菌体利用，这种氮源叫做迟效氮源
   • 速效氮源有利于菌体生长，迟效氮源有利于代谢产物合成
   • 氨基酸异养型微生物（营养缺陷型）：没有将无机氮合成有机氮的能力，需要从外界吸收现成的氨基酸作为氮源才能生长
3. 能源
4. 生长因子：是一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物（如维生素）
   • 营养缺陷型微生物：缺乏合成生长因子能力的微生物
5. 无机盐
6. 水分

5.2 微生物的营养类型

• 根据生长所需营养物质的性质分类
  • 异养型生物：在生长时需要以简单的有机物质作为营养物质
  • 自养型生物：在生长时能以简单的无机物质作为营养物质
• 根据生长时能量的来源不同分类
  • 化能营养型生物：依靠化合物氧化释放的能量进行生长
  • 光能营养型生物：依靠光能进行生长

5.3 培养基

5.3.1 培养基的配置原则

1. 目的明确：根据不同微生物的营养需要配置不同的培养基
2. 营养协调：注意各种营养物质的浓度与配比
3. 理化适宜：控制培养基的理化条件
4. 经济节约：应尽量考虑利用价廉且易于获得的原料作为培养基的成分

5.3.2 培养基的类型

按成分来源分类

• 合成培养基（组合培养基）
• 天然培养基
• 半组合培养基

按物理状态分类

• 固体培养基
• 半固体培养基
• 液体培养基

按用途/功能分类

• 加富培养基
• 选择培养基
• 鉴别培养基 eg. 伊红美蓝培养基

5.4 营养物质进入细胞

5.4.1 影响营养物质进入细胞的因素

1. 营养物质本身的性质
2. 微生物所处的环境
3. 微生物细胞的透过屏障

5.4.2 方式及特点

• 单纯扩散
  • 不消耗能量，非特异性
• 促进扩散（易化扩散）
  • 不消耗能量，特异性，需要载体蛋白
• 主动运输
  • 消耗能量，可逆浓度，特异性，需要载体蛋白
• 膜泡运输
  • 消耗能量

5.4.3 主动运输

• 初级主动运输
  • 最终造成细胞膜内外质子浓度差，使膜处于充能状态，即形成能化膜energized membrane
• 次级主动运输
  • 在细胞膜内外质子浓度差消失的过程中，偶联其它物质的运输
  • 分为同向运输symport、逆向运输anTIPort、单向运输uniport三种形式
• 基因转位：被运输物质运输过程发生了化学结构上的变化，主要存在于厌氧微生物中

钠钾泵 每次消耗1ATP，泵出3Na+，泵进2K+ 作用：维持细胞渗透压；维持细胞内K+多，细胞外Na+多

5.4.4 膜泡运输membrane vesicle transport

• 胞吞作用phagocytosis：膜泡中包含的是固体营养物质
• 胞饮作用pinocytosis：膜泡中包含的是液体
• 膜泡运输的五个时期：
  1. 吸附期
  2. 膜伸展期
  3. 膜泡迅速形成期
  4. 附着膜泡形成期
  5. 膜泡释放期

5.5 纯培养

• 概念： 从一个细胞中得到的后代称为纯培养
• 获得纯培养的方法
  • 稀释倒平板法（涂布平板法适合好氧菌，稀释倒平板法适合厌氧菌）
  • 划线法
  • 单细胞挑取法
  • 利用选择培养基培养法

5.6 测定生长繁殖的方法

5.6.1 测生长量

• 直接法
  • 测体积
  • 称干重
• 间接法
  • 比浊法
  • 生理指标法（测含C量/测含N量 etc.）

5.6.2 计繁殖数

• 直接法：血球计数法
• 间接法
  • 液体稀释法
  • 平板菌落计数法

5.7 微生物的同步生长

• 定义： 采用一定方法使细胞群体处于分裂步调一致的状态
• 方法：
  • 通过环境条件诱导同步生长群体
  • 通过物理方法选择同步生长群体
    • 梯度离心方法
    • 过滤分离法
    • 硝酸纤维素滤膜法

5.8 连续培养continuous culture of microorganisms

• 定义： 在培养期间，通过一定方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法
• 方法：
  • 恒浊法：将细胞浓度作为检测指标
  • 恒化法：将某生长限制性物质浓度作为检测指标

5.9 微生物的生长规律

• 将纯种单细胞微生物接种到一定溶剂的液体培养基后，在适宜条件下培养，定时取样测定细胞数量。以细胞数目的对数值做纵坐标，以培养时间做横坐标绘制的曲线，称为细菌的生长曲线growth curve

5.9.1 延滞期Lag phase

• 细菌体积增大，代谢活跃
• 特点：
  • 生长速度常数R为零
  • 细胞体积急剧增大
  • rRNA含量增高，细胞呈嗜碱性
  • 合成代谢活跃，易产生诱导酶
  • 对外界不良环境条件敏感
• 影响延滞期长短的因素：
  • 接种龄
  • 接种量
  • 培养基成分
• 发酵工业上需尽量缩短该期，以降低生产成本
• 食品工业上尽量在此期进行消毒或灭菌

5.9.2 对数期Logarithmic phase

• 细菌形态、染色、生物活性很典型
• 特点：
  • 生长速度常数R最大
  • 细胞进行平衡生长
  • 酶系活跃，代谢旺盛
• 影响对数期微生物增代时间的因素：
  • 菌种
  • 营养成分
  • 营养物的浓度
  • 培养温度
• 发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度
• 食品工业上尽量使有害微生物不能进入该期

常用参数

繁殖代数n 对数生长方式：1，2，4，8，……，2^n n = 3.322 (lnx' - lnx) 生长速度常数R R = n / (t’ - t) 代时G G = 1 / R

5.9.3 稳定期Stationary phase

• 细胞数保持恒定
• 特点：
  • 生长速度常数R = 0
  • 菌体产量达到了最高值
  • 合成次生代谢产物
  • 细胞内出现储藏物质，芽孢菌开始产生芽孢
• 产生原因：
  • 营养物尤其是生长限制因子的耗尽
  • 营养物的比例失调，如碳氮比不合适
  • 有害代谢废物的积累
  • 理化条件变得越来越不合适

5.9.4 衰亡期Decline phase

• 活菌数与培养时间呈反比
• 特点：
  • 生长速度常数R为负值
  • 细胞形态发生变化，出现不规则的衰退形
  • 释放次生代谢产物、芽孢等
  • 菌体开始自溶
• 产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡

主要生长参数

迟缓时间： 菌体达到对数期所需时间与理想条件下达到对数期所需时间之差 比生长速率： 表示生长速度与生长基质浓度之间的关系，当营养物质浓度很低时，比生长速率与营养物质浓度成正比 总生长量： 通过培养获得的微生物总量与原来接种的微生物量之差 产量常数： 总生长量与消耗基质总量之比

5.10 影响微生物生长的主要因素

5.10.1 温度

• 影响途径
  • 影响酶活
  • 影响膜流动性
  • 影响溶解度
• 处于最适温度，生长速度最快，代时最短
• 超过最低生长温度，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡
• 超过最高生长温度，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡
• 低温型微生物 最适温度5 - 20 ℃
• 中温型微生物 最适温度20 - 40 ℃
  1. 室温型：腐生或植物寄生
  2. 体温型：寄生在人或动物体内
• 高温型微生物 最适温度50 - 60 ℃
  • 生长速度快，可及时修复高温损伤
  • 生长曲线各个时期均短暂，可能检测不到
  • 在减少能源消耗、减少污染、缩短发酵周期方面具有重要意义

微生物耐热性表示方法

热力致死时间： 在特定温度、特定条件下杀死一定数量的微生物所需要的时间 F值： 一定基质，121.1 ℃，杀死一定量微生物所需时间 D值： 利用一定温度进行加热，活菌减少一个对数周期（90%活菌被杀死）所需时间 Z值： 在加热致死曲线中，时间降低一个对数周期（缩短90%加热时间）所需升高的温度

• 影响微生物对热抵抗的因素
  • 菌种的遗传特性 球菌 > 杆菌（非芽孢）
  • 菌龄 对数期抗热差
  • 微生物的数量 数量越多，抗热性越强
  • 基质的特性 含水量下降，抗热性提高；糖类可提高抗热性
  • 加热的时间与温度

5.10.2 氧气

• 菌种分类
  • 好氧菌
    • 专性好氧菌
    • 兼性厌氧菌
    • 微好氧菌
  • 厌氧菌
    • 耐氧菌
    • （专性）厌氧菌
• 氧毒害机制： 厌氧菌缺乏SOD无法消除超氧阴离子自由基，各种生物大分子和膜被其破坏，由此产生毒害

5.11 消毒与灭菌

5.11.1 消毒与灭菌相关概念

• 死亡：微生物不可逆地丧失生长、繁殖能力
• 防腐：采取抑菌措施
• 无菌：没有活的微生物的状态
• 消毒：采用较温和的理化因素，仅杀死物体中病原微生物的措施
• 灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施
• 商业灭菌：食品经杀菌后按规定检测方法无活的微生物检出，或仅检出极少数非病原微生物且他们不能生长繁殖
• 高温灭菌法分类
  1. 干热灭菌法
  2. 湿热灭菌法

5.11.2 干热灭菌法

• 火焰灭菌法：用外焰烧红
• 干燥加热空气灭菌法：160 - 170 ℃处理1- 2 h

5.11.3 湿热灭菌法

常压下

• 煮沸消毒法：煮沸后保持15 - 30 min
• 巴氏消毒法：60 - 85 ℃处理15 - 30 min
• 间歇灭菌法：3 - 4次煮沸消毒
• 超高温瞬时灭菌法：135 - 137 ℃处理3 - 5 s

加压下

• 连续加压灭菌法
• 高压蒸汽灭菌法
  • 115 ℃处理20 - 30 min
  • 121.1 ℃处理15 - 20 min

5.11.4 影响高压蒸汽灭菌效果的因素

• 灭菌物体的含菌量
• 灭菌锅内空气的排除程度
• 灭菌物体的pH值
• 灭菌对象的体积
• 加热与散热的速度

5.11.5 高温对培养基的影响

• 形成沉淀物
• 破环营养
• 提高色泽
• 改变培养基的pH
• 降低培养基浓度
• 补救措施：
  • 采用特殊的加热灭菌法（分别灭菌再合并）
  • 过滤除菌法
  • 加入螯合剂 如加EDTA防止金属离子沉淀