分子生物学 第 2 章 第 3 节：DNA 的复制
#分子生物学 #复制 #DNA聚合酶
- dNTP：脱氧核苷三磷酸
- ddNTP：双脱氧核苷三磷酸 （不能形成 3'-5'磷酸二酯键而掺入 DNA 链）
2.3.1 DNA 复制概念辨析
复制子与复制叉
- 复制子replicon：能独立进行复制的单位。从复制起始点origin到终止点的区域为一个复制子。一个复制子只包含一个复制起始点
- 复制叉replication fork：复制时，双链 DNA 要解开成两股链分别进行，这个复制起始点呈现叉子的形式，故被称为复制叉
复制起始点与终止点
- 起始点可以启动单向复制或双向复制。双向复制中，复制叉从起始点开始沿着相反方向等速前进
- 复制起始点的共同特点：含有丰富的 AT 序列，可能有利于 DNA 复制启动时双链的解开 （A - T 配对只形成两条氢键，易解开）
| 生物 / 细胞器 | 复制形式 |
|---|---|
| 细菌、病毒、线粒体 DNA | 单复制子 |
| 真核生物 | 多复制子 |
- 真核生物复制子并非同时起作用，一般只有不超过 15% 的复制子进行复制
- 细胞内复制子数目与复制子移动速度成反比
- 复制终止点terminus：复制子中控制复制终止的位点
- 大肠杆菌 cDNA 中，复制终止点在起始点的相对位置（旋转 180°），复制从起始点双向进行，复制叉向两个相反方向延 cDNA 前进，最后两个复制叉相遇在一个位点而停止，该位点即为终止点
DNA 复制方向
- 单向复制
- 双向复制 （最普遍）
- 相向复制 （如：腺病毒等某些线性DNA病毒）
放射自显影实验判断 DNA 复制的方向性
- 复制开始时用低放射性 $^3H$ 脱氧胸苷标记 E.coli ，数分钟后转移到高放射性培养基中继续标记。复制起始区放射性标记密度低，感光还原的银颗粒密度也比较低
- 单向复制：银颗粒密度分布一端低，一端高
- 双向复制：银颗粒密度分布中间低，两端高
DNA 复制速度
- 细菌DNA 只有一个复制起始点，所以其复制叉移动速度比真核生物快 20-50 倍
- 对一个生物体基因组来说，复制起始点是固定的，复制叉移动方向与速度以双向等速方式为主
2.3.2 DNA 的半保留复制
- 定义：每个子代分子的一条链来自亲代 DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式被称为 DNA 的半保留复制semiconservative replication
- DNA 在复制过程中碱基间的氢键首先断裂，双螺旋解旋并被分开，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链
DNA 半保留复制的验证实验
- $^{15}N$ 培养基培养大肠杆菌
- 移入 ${14}N$ 继续培养一代，CsCl 密度梯度离心，DNA 密度在 ${15}N-DNA$ 和 ${14}N-DNA$ 之间，说明形成了一半 ${15}N$ 一半 $^{14}N$ 的杂合 DNA 分子
- 继续在 ${14}N$ 培养基中培养，CsCl 密度梯度离心，发现 ${14}N-DNA$ 增多
- DNA 半保留复制的意义：保证了 DNA 在代谢上的稳定性。经过许多代复制，DNA 多核苷酸链仍可完整地存在于后代而不被分解掉。这种稳定性与DNA 的遗传功能相符
2.3.3 冈崎片段与半不连续复制semidiscontinuous replication
| DNA 半不连续复制中的子代链 | 英文 |
|---|---|
| 前导链 | leading strand |
| 后随链 | lagging strand |
- 冈崎片段：沿着后随链的模板链合成的新 DNA 片段
- DNA 复制过程中至少有一条链首先合成较短的冈崎片段，然后再由连接酶连接成大分子 DNA
- DNA 复制方向：从 5' 到 3'
- 因为 DNA 聚合酶只能在 3'-OH 上添加核苷酸
2.3.4 DNA 聚合酶
- 具有催化选择性
- DNA 聚合酶DNA polymerase用一个活性位点催化 4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP）的添加
- DNA 聚合酶的结构域
- 手掌域：含有催化位点的基本原件，由一个 β 折叠构成，还负责检查最新加入的核苷酸碱基配对的准确性
- 手指域：包围住 dNTP，使引入的核苷酸和金属离子密切接触，促进催化反应
- 拇指域：维持引物以及活性部位的正确位置，促进 DNA 聚合酶与其底物之间的紧密连接，有助于添加更多 dNTP
- DNA 聚合酶的延伸能力processivity：指每次聚合酶与模板-引物结合时所能添加的核苷酸的平均数
- 校正外切核酸酶proofreading exonuclease具有校正新合成 DNA 的能力，可把错误核苷酸从引物链的 3' 端除去
- 校正外切核酸酶将不正确配对碱基发生概率降低至每添加 $10^7$ 个核苷酸出现一次
- 复制后错配修复将不正确配对碱基发生概率降低至每添加 $10^{10}$ 个核苷酸出现一次
2.3.5 滑动 DNA 夹
- 滑动 DNA 夹sliding DNA clamp：一种蛋白质，是一个闭合的环，由 5 个亚基组成的滑动夹装载器sliding clamp loader通过结合和水解ATP催化滑动夹的打开，并将其安放在 DNA 的引物-模板接头上
- 滑动 DNA 夹的作用：与 DNA 聚合酶结合，组成“油炸圈饼”结构，保持聚合酶与 DNA 的紧密接触，从而大大增加了 DNA 的延伸能力（需要 ATP）
- 滑动 DNA 夹是生物 DNA 复制体系中必不可少的保守部件