分子生物学 第 5 章 第 1 节：DNA 基本操作技术

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[!NOTE] 第五章卷帙浩繁，全盘记忆所耗不赀。不妨提纲挈领地学，正所谓纲举而目张。笔者谨列出本章的几处肯綮供读者引以为本章学习的主线与关节，方便读者们在此基础上归纳理解

• 技术的原理
• 技术所需的条件：如酶、反应条件
• 技术所需的原料
• 技术的大致步骤
• 技术的应用

• 分子生物学三大成就

5.1.1 重组 DNA 技术讲略

• 重组 DNA 的核心：用限制性内切核酸酶 （restriction endonuclease，RE） 和 DNA 连接酶对 DNA 分子进行体外切割和连接
• 工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件
• 载体 vector：具备自主复制能力的 DNA 分子
  • 如病毒、噬菌体、质粒
• pSC101
  • 第一代质粒载体
  • 带有四环素抗性基因 $tet^r$

pSC101质粒是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，平均每个宿主细胞仅有 1-2 个拷贝，因此，从带有质粒的宿主细胞中很难大量提取质粒 DNA，不利于后续实验进行

• 大肠杆菌细胞经适量氯化钙 $CaCl_2$ 处理后，能有效摄取质粒、吸收 λ 噬菌体 DNA （处于感受态）
• 把非洲爪蟾核糖体蛋白基因片段与 pSC101 质粒 DNA 片段重组后导入大肠杆菌，证明动物基因也能进入大肠杆菌细胞并转录出相应的 mRNA 分子

5.1.2 蓝白斑实验

graph TD
A(IPTG) --> |诱导表达| B(laz'基因)
B(laz'基因) --> |编码| C(β- 半乳糖苷酶 α- 肽)
C(β- 半乳糖苷酶 α- 肽) --> |互补| D(宿主缺陷型 β- 半乳糖苷酶)
D(宿主缺陷型 β- 半乳糖苷酶) --> E[β- 半乳糖苷酶产生活性]
E[β- 半乳糖苷酶产生活性] --> |水解| F(X-gal)
F(X-gal) --> |生成| G(溴氯吲哚（蓝色）)

• 实验结果分析
  • 蓝色：说明菌落未被转化
  • 白色：说明菌落被转化， laz' 基因被破坏，β- 半乳糖苷酶无法产生活性，因此无法水解 X-gal 产生蓝色的溴氯吲哚

5.1.3 基因组 DNA 的提取

基因组genome的定义

• 广义：指一个单倍体细胞内细胞核、线粒体和叶绿体中所包含的全部 DNA 分子
• 狭义：细胞核内染色体上的包括编码区和非编码区在内的全部 DNA 分子

• DNA 提取实验大致流程

graph TD
F(细胞样品) --> A(研磨分散)
A(研磨分散) --> B(裂解细胞)
B(裂解细胞) --> |苯酚、氯仿抽提| C(组分分离)
C(组分分离) --> |取水相| D(乙醇洗涤纯化)
D(乙醇洗涤纯化) --> |蒸馏水或 TE 缓冲液溶解| E[4℃保存]

• 对植物组织样品
  • 用液氮速冻帮助研磨
  • 加入 CTAB （阳离子去垢剂） 裂解
• 对动物组织样品或细胞样品
  • 加入 SDS （阴离子去垢剂） 裂解
• 苯酚的作用：蛋白质变性剂
• 裂解细胞后，也可选择用硅胶膜纯化柱吸附，最后在低盐浓度下洗脱
• TE 缓冲液 = Tris-HCl + EDTA （保护 DNA）

DNA 浓度和纯度的测定

• 通过 $OD_{260}$ 和 $OD_{280}$ 来判断
• $OD_{260}$ = 1 时相当于浓度为 50 μg/mL
• $OD_{260}$ / $OD_{280}$ 的比值在 1.8-2.0 之间，代表所提取的 DNA 纯度较好

5.1.4 核酸凝胶电泳

• 按相对分子质量分离 DNA，相对分子量越大，电泳跑得越慢
• 电泳的介质：
  • 琼脂糖agarose
  • 聚丙烯酰胺凝胶polyacrylamide
• 原理：在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，把这些核酸分子放置在电场当中，它们会向正电极移动。在一定电场强度下，DNA 分子的迁移速度完全取决于核酸分子本身的大小
• 凝胶的分辨能力与凝胶的类型和浓度有关
  • 凝胶浓度越高，凝胶介质孔隙越小，分辨能力越强

溴化乙锭 （ethidium bromide， EB）：能插入到核酸分子的相邻碱基之间，并在紫外光（300 nm 波长为检测最宜）照射下发出荧光

• 脉冲电场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresis：用于分离超大相对分子质量的 DNA

5.1.5 聚合酶链式反应技术

• 原理：将模板 DNA 加热至临近沸点，变性解链成单链 DNA 分子，然后以之为模板在 DNA 聚合酶 （Taq 酶） 的催化下利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷酸（dNTP）合成 DNA 互补链
• PCR 所用 DNA 聚合酶 （Taq 酶） 的特点：耐高温
• 原料：
  • 模板 DNA
  • 引物
  • dNTP
  • 缓冲液
• 由于在 PCR 反应种所选用的一对引物是按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的，因此，每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝相反方向延伸的，每一条新合成的 DNA 链上都具有新的引物结合位点
• PCR 的过程（一般进行 30 轮左右）：
  1. 变性：DNA 解链
  2. 退火：引物与模板 DNA 相结合
  3. 延伸：DNA 互补链合成

5.1.6 重组载体的构建

• 对引物的要求：
  • 长度一般为 18-27 bp
  • GC 含量控制在 40%-60%
  • $T_m$ 值在 60℃左右
• 对核酸外切酶的要求：与载体上的多克隆位点相匹配
• 重组载体构建的流程

graph TD
A(获取目的基因片段) --> B(合成目的基因两端的引物)
B(合成目的基因两端的引物) --> C(PCR 扩增目的基因片段)
C(PCR 扩增目的基因片段) --> |琼脂糖凝胶电泳检测| D(外切核酸酶分别双酶切目的基因片段和载体 DNA) 
D(外切核酸酶分别双酶切目的基因片段和载体 DNA) --> E[T4 DNA 连接酶进行连接反应]
E(T4 DNA 连接酶进行连接反应) --> |转导入大肠杆菌感受态细胞| F(扩培) 
F(扩培) --> |菌落 PCR 扩增鉴定| G(挑取阳性菌再扩培)
G(挑取阳性菌再扩培) --> H(裂解法提取质粒 DNA)
H(裂解法提取质粒 DNA) --> I(纯化)

感受态细胞：细胞膜通透性发生改变，易于吸附外源 DNA 的细胞

5.1.7 实时定量 PCR

• PCR 技术具有极高的敏感性，扩增产物总量的变异系数常常达到 10%-30%
• 实时定量 PCR （real time quantitative PRC，qPCR）：利用荧光检测的 PCR 仪对整个 PCR 过程扩增 DNA 的积累速率绘制动态变化图，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题

TaqMan 探针

• 特异性
• 将荧光染料（不同波长）固定在探针上，PCR 扩增，探针在这一过程中被 DNA 聚合酶降解，解除了荧光淬灭的束缚，荧光基团因此得以在激发光下发出荧光。所产生的荧光强度直接反映了被扩增的靶 DNA 总量

STBR Green Ⅰ 染料

• 非特异性
• 荧光染料 STBR Green Ⅰ激发光波长为 520 nm，这种荧光染料只能与双链 DNA 结合
• PCR 扩增出的 DNA 双链被 STBR Green Ⅰ结合而发出荧光

5.1.8 基因组 DNA 文库的构建

基因组文库相关概念

• 基因组的 DNA 文库：基因组中所有 DNA 序列克隆的总汇
• 基因组 DNA 文库的构建：把某种生物的基因组 DNA 切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆
• 作用：常被用于分离特定的基因片段、分析特定基因结构、研究基因表达调控，还可以用于全基因组物理图谱的构建和全基因组序列测定等

• 基因组 DNA 文库构建的第一步：制备合适大小的随机 DNA 片段，在体外将这些 DNA 片段与适合的载体 （最常用的载体：λ 噬菌体） 相连成重组子，转化到大肠杆菌或其他受体细胞中，从转化子克隆群中筛选出含有靶基因的克隆
• 提高文库代表性的方法 1. 用机械切割法或限制性核酸内切酶切割法随机断裂 DNA，以保证克隆的随机性 2. 增加文库重组克隆的数目，以提高覆盖基因组的倍数
• 构建基因组文库常用：
  • λ 噬菌体载体
  • 限制性核酸内切酶部分消化法
• λ 噬菌体文库构建方法简单高效，所获得的文库易于用分子杂交法进行筛选，因此被广泛应用于细菌、真菌等基因组较小物种的研究
• 高容量克隆载体
  • 举例：科斯质粒、细菌人工染色体BAC、P1 源人工染色体PAC、酵母人工染色体YAC
  • 优点：可以插入大片段 DNA
  • 应用：基因组作图、测序和克隆序列的比对