分子生物学 第 3 章 第 4 节：RNA 聚合酶、RNA 转录及其抑制剂

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3.4.1 RNA 聚合酶

原核生物 RNA 聚合酶

• 原核生物 RNA 聚合酶全酶holoenzyme
  • σ 因子：辨认起始点，只与转录起始有关
  • 核心酶：转录延伸
    • 2 个 α 亚基
    • 1 个 β 亚基
    • 1 个 β' 亚基
    • 1 个 ω 亚基
• β 亚基和 β' 亚基是催化中心
• 2 个 α 亚基负责组装
• ω 亚基功能不明
• 原核生物转录的起始需要全酶参加，由 σ 因子辨认起始点，延长过程仅需要核心酶的催化

真核生物 RNA 聚合酶

• 真核生物中共有 3 类结构相对更复杂的 RNA 聚合酶，它们在细胞核中的位置不同，负责转录的基因不同

• 真核细胞三种 RNA 聚合酶中，聚合酶Ⅱ对α-鹅膏蕈碱最敏感
• 45 S rRNA 前体经剪接修饰后，生成除了 5 S rRNA 以外的各种 rRNA
• hnRNA 经剪接加工后生成 mRNA
• 核内小 RNA（snRNA）参与 hnRNA 的剪接加工
• 除了细胞核中的 RNA 聚合酶之外，真核生物线粒体和叶绿体中还存在不同的 RNA 聚合酶。线粒体和叶绿体 RNA 聚合酶活性不受 α-鹅膏蕈碱所抑制
• 由 RNA 聚合酶Ⅱ 所转录的编码蛋白质的基因数目最多

3.4.2 启动子promoter

原核生物的启动子

• Pribnow 区 (Pribnow box) : 又称为 -10 区，中央大约位于起点上游 10 bp 处

Pribnow 实验

1. 使 RNA 聚合酶全酶与模板 DNA 结合
2. 用 DNaseⅠ 水解 DNA，然后用酚抽提
3. 沉淀纯化 DNA 后，得到一个被 RNA 聚合酶保护的 DNA 片段，有 41-44 bp
4. 保护区内有一个 5 bp 组成的共同序列，是 RNA 聚合酶的紧密结合点，即 Pribnow 区
5. 提纯被保护的片段后发现，RNA 聚合酶仍不能重新结合或选择正确的起始点，表明保护区外还存在与 RNA 聚合酶识别有关的序列，即 -35 区

• 原核生物 RNA 聚合酶与启动子结合的位点：

• 这两个结合位点能与 σ 因子相互识别而具有很高的亲和力
• 启动子对两区间距有要求
  • -35 区与 -10 区之间的举例通常为 16-19 bp
  • 小于 15 bp 或大于 20 bp 都会降低启动子活性
• 大肠杆菌 RNA 聚合酶与启动子的相互作用主要包括：启动子区的识别、酶与启动子的结合、σ 因子的结合与解离

真核生物的启动子

• 真核生物基因由三类不同的 RNA 聚合酶负责转录，这些基因的启动子结构也各有特点
• 真核生物中由 RNA 聚合酶Ⅱ 催化转录的 DNA 序列 5' 上游区有一段与原核生物 Pribnow 区相似，富含 TA 的保守序列，称为 TATA 区 TATA box
• 真核生物启动子
  • TATA 区：-25 bp ~ -35 bp，核心启动子的组成部分
  • 转录调控区（控制转录起始频率）：
    • CAAT 区：-70 bp ~ -80 bp
    • GC 区：-80 bp ~ -100 bp
  • 上游启动子元件upstream promoter element，UPE（上游激活序列upstream activating sequence，UAS）：TATA 区上游的保守序列
• CAAT 区对转录起始频率的影响最大
• 并非每个基因的启动子区都包含这三种序列
• 真核细胞中存在着大量特异性或组成型表达的、能够与不同基因启动子区 UPE 结合的转录调控因子
• 基因转录实际上是 RNA 聚合酶、转录调控因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果

辨析特异性表达和组成型表达

• 特异性表达：受调控
• 组成型表达：总是表达

[!NOTE] 特异性表达与组成型表达的区别类似于组成酶和诱导酶之间的关系

3.4.3 原核生物 RNA 转录周期

① 转录起始

• RNA 聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物closed complex，此时，DNA 链仍处于双链状态
• 伴随 DNA 构象上的重大变化，封闭复合物转变为开放复合物open complex，聚合酶全酶所结合的 DNA 序列中有一小段双链被解开
• 开放复合物与最初的两个 NTP 相结合，并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后，转变成包括 RNA 聚合酶、DNA 和新生 RNA 的三元复合物ternary complex

三元复合物的两条去向

之一、流产式起始

• 合成并释放 2-9 个核苷酸的短 RNA 转录物
• 原因：RNA 聚合酶合成长度若小于 10 个，这些产物若不进一步延长，新生的 RNA 链与 DNA 模板结合就不够牢固，很容易从 DNA 链上脱落并导致转录重新开始

之二、转录进入正常的延伸阶段

• 若 RNA 聚合酶成功合成 10 个及以上核苷酸，就形成了一个稳定的三元复合物并离开启动子区，进入延伸阶段

② 新生 RNA 链延伸

• 新生 RNA 链长度达到 9-10 个核苷酸时，σ 亚基从转录复合物的 RNA 聚合酶全酶上脱落下来，RNA 聚合酶离开启动子，核心酶沿模板 DNA 链移动并使新生 RNA 链不断延长
• 延伸 RNA 聚合酶同时具有合成和校对两种功能

RNA 聚合酶的校对机制

之一、焦磷酸编辑pyrophosphorolytic editing

• 聚合酶利用其活性位点，在一个简单的逆向反应中，通过重新加入焦磷酸来去除错误插入的核糖核苷酸
• 这种修复方法既可以去除错误碱基，也可以去除正确碱基。去除错误碱基的效率更高

之二、水解编辑hydrolytic editing

• 由一些 Gre 因子激发
• Gre 因子可帮助聚合酶快速延伸，同时去除含有错误配对的序列

[!NOTE] 焦磷酸编辑去除错误核苷酸的原理其实就是勒夏特列原理

NTP + 核苷酸链 $\Leftrightarrow$ 核苷酸-AMP + PPT

• 在一个可逆反应中，如果增加产物浓度，则平衡向负方向移动
• 通过增加焦磷酸 PPT，增加了产物浓度，反应向负方向移动，即达到了去除错误插入核苷酸的效果

③ 转录终止

[!TIP] 埋个伏笔，后文 Trp 操纵子还会再见

• RNA 聚合酶碰上终止信号时停止加入新的核苷酸，新生 RNA 链与模板 DNA 相脱离而被释放
• 终止子intrinsic terminator：又称为内在或固有终止子，指模板 DNA 链上存在的终止转录的特殊信号
  • 每个基因或操纵子都有一个启动子和一个终止子
  • 终止子的结构特点
    1. 终止位点上游一般存在一个富含 GC 碱基的反向重复序列，由这段 DNA 转录产生的 RNA 容易形成发夹结构
    2. 在终止位点前面有一段由 4-8 个 A-T 碱基对序列，其转录产物的 3' 端为寡聚 U
  • 终止子的这些元件要在它们被转录后才会影响聚合酶，即它们是以 RNA 形式发挥作用的，这种结构特征的存在决定了转录的终止
• 大肠杆菌中的终止子分类（按是否需要辅助因子参与才能终止转录分）
  • 不依赖于 ρ 因子
    • 转录终止没有任何其他因子参与，核心酶就能终止基因转录
  • 依赖于 ρ 因子
• ρ 因子是 RNA 聚合酶终止转录的重要辅助因子
  • 作用机制：穷追hot pursuit模型

3.4.4 真核细胞转录起始复合物的组装

• 真核生物 RNA 聚合酶不能直接识别基因的启动子区，需要至少七种转录调控因子 （transcription factor，TF） 按特定顺序结合于启动子上，帮助 RNA 聚合酶特异性地结合到靶基因的启动子上并解开 DNA 双链
• 转录调控因子：属于蛋白质，功能类似于原核生物中的 σ 因子，起识别启动子的作用
• 许多转录调控因子本身包含多个亚基，它们与 RNA 聚合酶形成转录前起始复合物 （preinitiation transcription complex，PIC），保证转录有效起始
• PIC 装配过程有严格的顺序性，如果缺少一种或集中成分，则不能起始转录，或者只有很低的转录速率

3.4.5 增强子enhancer

• 定义：能强化转录起始的序列
• 增强子的特点 【重要】
  1. 远距离效应：可增强远处启动子的转录
  2. 无方向性：无论位于靶基因的上游、下游或内部都可发挥增强转录的作用
  3. 顺式调节：只调节位于同一染色体上的靶基因
  4. 具有组织特异性
  5. 无物种和基因的特异性：可连接到异源基因上发挥作用
  6. 有相位性：其作用和 DNA 的构象有关
  7. 某些增强子可应答外部信号：如热休克基因在高温下才表达；金属硫蛋白基因在镉和锌的存在下才表达；一些增强子可被固醇类激素所激活

[!TIP] 记忆口诀：远方吮特种翔鹰

• 远：远距离
• 方：方向性
• 吮：顺式
• 特：组织特异性
• 种：无物种和基因的特异性
• 翔：相位性
• 鹰：应答外部信号

3.4.5 RNA 转录的抑制

• 三类转录抑制剂

[!NOTE]

• 碱基类似物可作为代谢拮抗物直接抑制核苷酸合成有关的酶类，或者通过掺入核酸分子形成异常的核酸结构，从而影响核酸的进一步延伸
• 碱基类似物进入体内后一般先转变成相应的核苷酸后才能发挥抑制作用
• 放线菌素 D 具有抗菌和抗癌作用，是 DNA 模板功能的抑制剂，可与 DNA 形成非共价复合物，抑制其作为模板的功能
• 嵌入染料可插入双链 DNA 相邻的碱基对之间
• 溴化乙锭ethidium bromide，EB：一种高敏感度的荧光试剂，与核酸结合后抑制其复制和转录。实验中常用 EB 来检测样品中的 DNA 和 RNA 浓度