分子生物学 第 5 章 第 2 节：RNA 基本操作技术

#分子生物学 #实验技术 #RNA #mRNA #提取 #cDNA #基因组 #基因工程 #非编码RNA

cDNA （complementary DNA） ：mRNA 反转录得到的 DNA，不含冗余序列，代表了生物体某一器官或组织 mRNA 中所含的全部或绝大部分遗传信息。通过特异性探针筛选 cDNA 文库，可以较快地分离到相关基因

  • 由于单链 RNA 分子不稳定且易发生降解，在自然状态下难以被扩增，因此，为了研究 mRNA 所包含的功能基因信息，一般将其反转录成稳定的 DNA 双螺旋，再插入到可以自我复制的载体中

5.2.1 总 RNA 的提取：异硫氰酸胍-苯酚抽提法

  • 细胞中总 RNA 包括：
    • 编码蛋白质的 mRNA
    • 不编码蛋白质的 ncRNA （包括：rRNA、tRNA 以及其他 RNA）

Trizol 试剂

  • 主要由异硫氰酸胍和苯酚组成
  • 可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的 RNA 释放出来，并使核糖体蛋白于 RNA 分子分离，还能保证 RNA 的完整
  • 提取过程：
graph TD
A(样品) --> |加入 Trizol 试剂| B(液氮研磨，破碎细胞并溶解细胞成分)
B(液氮研磨，破碎细胞并溶解细胞成分) --> |氯仿抽提，离心| C(取水相)
C(取水相) --> |加入异丙醇沉淀| D(获得较纯的总 RNA)

[!TIP] 要根据不同植物组织的特点，预先去除酚类、多糖或其他次生代谢产物对 RNA 的干扰

RNA 浓度和纯度的判断

  • 通过 $OD_{260}$ 和 $OD_{280}$ 来判断
  • $OD_{260}$ = 1 时相当于浓度为 50 μg/mL
  • $OD_{260}$ / $OD_{280}$ 的比值在 1.8-2.0 之间，代表所提取的 DNA 纯度较好

[!NOTE] 其实此处 RNA 浓度和纯度的判断与上文 DNA 浓度的判断大致相同，区别在于 OD 260/280 比值较大

5.2.2 mRNA 的纯化

  • 真核细胞 mRNA 的 poly（A）尾真核生物 mRNA 的提取提供了极为方便的选择性标志
  • 实验中常用寡聚（dT）-纤维素柱层析法获得高纯度的 mRNA
    • 利用 mRNA 3' 端含有 poly（A）的特点，当 RNA 流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA 被特异性地结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱 mRNA
    • 原理：碱基互补配对
  • poly（AT）Tract mRNA 分离系统：将生物素标记的寡聚（dT）引物与细胞总 RNA 温育，加入微磁球相连的抗生物素蛋白以结合 poly（A）mRNA，通过磁场吸附作用将之分离出来

5.2.3 cDNA 的合成

  • 从 DNA 的合成包括第一链和第二链 cDNA 的合成
    • 第一链的合成是以 mRNA 为模板，反转录时加入寡聚（dT）做引物，在反转录酶的催化下形成 cDNA
    • 第二链 cDNA 的合成是以第一链为模板，由 DNA 聚合酶催化
  • 在 cDNA 合成过程中应选用活性较高的反转录酶及甲基化 dCTP，cDNA 两端应加上不同内切酶所识别的接头序列，保证所获得双链 cDNA 的方向性

[!WARNING] 为什么要加入甲基化的 dCTP？

  • 保证新合成的 cDNA 链被甲基化修饰，以防止构建克隆时被限制性内切酶切割
  • 绝大多数大肠杆菌都会切除带有 5'-甲基胞嘧啶的外源 DNA，所以实验中常选用 $mcrA-$ 和 $mcrB-$ 菌株以防止 cDNA 被降解

5.2.4 cDNA 文库的构建

  • 应用：筛选目的基因、大规模测序、基因芯片杂交等功能基因组学研究

5.2.5 基因文库的筛选

  1. 核酸杂交法
    • 广泛的适用性和快速性，最常用
    • 常用放射性标记的特异性 DNA 探针进行高密度的菌落杂交筛选
  2. PCR 筛选法
    • 通用性，操作简单
    • 使用前提：已知足够的序列信息并获得基因特异性引物
  3. 免疫筛选法
    • 原理：抗原抗体特异性结合
    • 适用于对表达文库的筛选，也即如果该 DNA 或 cDNA 文库是用表达载体构建的，每个克隆都可以在宿主细胞中表达，产生所编码的蛋白质，就可以用免疫筛选法进行筛选

5.2.6 非编码 RNA 的研究

  • ncRNA 的功能：在转录和翻译水平调控基因表达，维持基因组的稳定，或在细胞功能与命运的决定中发挥至关重要的作用
  • ncRNA 的分类
ncRNA 的分类举例
组成型 ncRNArRNA、tRNA
调控型 ncRNAmiRNA、siRNA、piRNA、snRNA、snoRNA、lcnRNA、circRNA

[!NOTE] 调控型 ncRNA 概述

  • miRNA （microRNA）：是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小 RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用
  • siRNA （small interfering RNA）：siRNA 是 siRISC 的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。详见：RNAi 技术
  • piRNA （piwi-interacting RNA）：piRNA是指 piwi 相互作用 RNA，是一类内源性小干扰 RNA，能特异性地与动物细胞中 Argonaute 蛋白的类似物 PIWI 结合
  • snRNA （small nuclear RNA）：核小 RNA，剪接体中的 5 种 RNA（U1、U2、U4、U5、U6）统称为 snRNA，参与 hnRNA 的剪接加工
  • snoRNA （small nucleolar RNA）：核仁小 RNA，参与核糖核酸酶对特定立体结构的识别，从而确定切割位点
  • lncRNA （long non-coding RNA）：指长度大于200 核苷酸的非编码RNA。lncRNA具有非常重要的调控功能，且几乎参与到了各种生物学过程和通路，与各种疾病的发生发展紧密关联
  • circRNA （circular RNA）：环状 RNA，虽然 circRNA 通常表达水平较低，但它们的表达存在细胞和组织特异性。circRNA 可以通过不同途径影响基因表达，有效扩展真核细胞转录组的多样性和复杂性，在细胞中扮演着重要角色
  • 目前只能依据 ncRNA 的大小和形态进行分离
  • 小于 50 nt 的 ncRNA 的分离：提取总 RNA 后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，再用乙醇沉淀出来

[!TIP] 符号约定：有关核酸的内容中，“nt”代表核苷酸（nucleotide）

  • 也可以从总 RNA 样品中去除 rRNA 和 tRNA，再分离其他 ncRNA
  • circRNA 的分离可利用其特殊的环状结构