分子生物学 第 5 章 第 5 节：基因克隆技术

• 克隆clone：具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体

  • 举例：同一受精卵分裂而来的同卵双胞胎monozygotic twins

  • 细胞水平上：由同一个祖细胞progenitor cell分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞

  • 分子生物学水平上：将外源 DNA 插入具有复制能力的载体 DNA 中，使之得以永久保存和复制的过程

5.5.1 RACE 技术（cDNA 末端快速扩增法）

• cDNA 末端快速扩增法 （rapid amplification of cDNA ends，RACE）：是一项再已知 cDNA 序列的基础上克隆 5’ 端或 3’ 端缺失序列的技术

• RACE 技术很大程度上依赖于 RNA 连接酶连接和寡聚帽子的快速扩增

• 操作步骤：

  1. 获得高质量的总 RNA

  2. 去磷酸化作用

  3. 去掉 mRNA 的 5’ 帽子，加特异性 RNA 寡聚接头并用 RNA 连接酶相连接

  4. 以特异性寡聚 （dT）为引物，在反转录酶的作用下，反转录合成第一条 cDNA 链，包括含了寡聚接头的互补序列

  5. 分别以第一链 cDNA 为模板进行 RACE 反应

  6. 将纯化后的 PCR 产物克隆到载体 DNA 中进行序列分析

5.5.2 RAMPAGE 技术

• RAMPAGE 技术 （RNA annotation and mapping of promoters for the analysis of gene expression）：是一种在全基因组范围内鉴定所有蛋白质编码基因和部分非编码 RNA 基因的转录起始位点，确定启动子的具体位置，并且能高通量检测基因表达水平的方法

• 提高酶热稳定性的方法：加入山梨醇和海藻糖

• 反转录酶的末端转移酶 （terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）：催化脱氧核糖核苷酸结合到 DNA 分子的 3’-OH 端，使反转录产生的 cDNA 3’ 端加上了 3 个胞嘧啶脱氧核糖核苷酸dCMP

5.5.3 Gateway 大规模克隆技术

• 利用 λ 噬菌体进行位点特异性 DNA 片段重组，实现了不需要传统的酶切联接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，为大规模克隆基因组注释的开放读码框ORF提供了保障

• Gateway 克隆技术主要包括 TOPO 反应和 LR 反应两步

  • TOPO 反应将目的基因 PCR 产物连入 Entry 载体

  • LR 反应被用于将目的片段从 Entry 载体中重组入表达载体

5.5.4 基因的图位克隆法

• 基因的图位克隆法maping-based cloning：是一种分离未知性状目的基因的方法

• 操作步骤

  1. 定位：通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的 RFLP 或 RAPD 分子标记

  2. 克隆：找出与目的基因距离最近的分子标记，通过染色体步移技术，将位于这两个标记间的基因片段分离并克隆出来

  3. 鉴定：根据基因功能互作原理鉴定目的基因

• 单子叶植物功能基因研究的模式系统：水稻基因组

5.5.5 热不对成交错多聚酶链式反应

• 热不对成交错多聚酶链式反应 （thermal asymmetric inter-laced PCR，TAIL-PCR）：用于扩增 T-DNA 插入位点侧翼序列，从而获得转基因植物插入位点特异性分子证据