分子生物学 第 2 章 第 4 节：原核生物和真核生物 DNA 复制的特点

2.4.1 原核生物 DNA 复制过程

• 复制起始点（oriC）含有 3 个 13bp 的串联重复保守序列GATCTNTTNTTTT以及 4 个由 9bp 的保守序列TTATACANA组成的能结合 DnaA 的起始结合位点

• 原核生物 DNA 复制过程：

  1. DNA 双螺旋的解旋

  2. DNA 复制的引发

  3. DNA 复制的延伸

  4. DNA 复制的终止

① DNA 双螺旋的解旋

• 在拓扑异构酶 I 的作用下解开负超螺旋，并与 DNA 解链酶共同作用，在复制起点处解开双链

• 参与解链的除了解链酶外，还有 Dna 蛋白等，一旦局部解开双链，就必须有 SSB 蛋白来稳定解开的单链，以确保该局部结构不会恢复成双链

• 接着，由引发酶等组成的引发体迅速作用于两条单链DNA 上

• 前导链和后随链均需要一段 RNA 引物以起始子链 DNA 的合成

② DNA 复制的引发

• DNA 聚合酶只能延长已存在的DNA 链，不能从头合成 DNA 链，因此，DNA 新链的起始需要一条 RNA 引物

引物 primer

• 提供 3’-OH

• 引物的合成需要引发酶（一种特殊的 RNA 聚合酶），且最后需切除

• 在体内，引物为RNA；在体外，引物为 DNA/RNA 均可

• 前导链只需要一个引物，而后随链每个冈崎片段都需要一个引物

• 后随链的引发过程往往由引发体primosome来完成

• 引发体前体preprimosome（包含六种蛋白） + 引发酶primase = 引发体

• 引发酶是dnaG基因的产物

• 引发体向后随链分叉方向前进，沿途断断续续地引发生成后随链的引物

• 引物产生后，DNA 聚合酶 III 在引物后合成 DNA，再由 RNase H 降解 RNA 引物并由 DNA 聚合酶 I 将缺口补齐，最后， DNA 连接酶将两个冈崎片段连在一起形成子代 DNA 链

• DNA 聚合酶可以利用 dNTP 高能磷酸键的能量，无需额外提供 ATP

• DNA 连接酶需要额外提供 ATP 才能完成功能

③ DNA 复制的延伸

1. 引物酶合成约 10 个核苷酸大小的新引物

2. DNA 聚合酶 III 以 5’ -> 3’ 方向延伸引物，直到遇见邻接引物的 5’ 端

3. 在E.coli中，DNA 聚合酶 I 具有 5’ -> 3’ 外切酶的活性，被用来去除引物

4. DNA 连接酶连接相邻的冈崎片段，使之成为一条完整的子代链

④ DNA 复制的终止

• 需要 Tus 蛋白

• 重复性终止子序列（Ter）：22 b

符号约定：有关核酸的内容中，“bp”代表碱基对，“b”代表碱基

2.4.2 原核生物的 DNA 聚合酶

• DNA 聚合酶 I

  • 可被蛋白酶切成两个区域：C 端区和 N 端区

  • C 端区大，又被称为 Klenow 片段，同时具有 DNA 聚合酶活性和 3’ -> 5’ 外切酶活性

  • N 端区小，具有 5’ -> 3’ 外切酶活性

• DNA 聚合酶Ⅱ

• DNA 聚合酶Ⅲ

  • 是大肠杆菌 DNA 复制中链延长反应的主导聚合酶

• DNA 聚合酶Ⅳ 和 DNA 聚合酶Ⅴ

  • 主要在 DNA 修复和跨损伤合成 （translesion synthesis，TLS） 过程中发挥作用

2.4.3 真核生物 DNA 复制的特点

1. 真核生物 DNA 每个细胞周期只精确复制一次

2. 真核细胞复制的起始需要在前复制复合体 pre-RC 的指导下进行

3. 细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）调控前复制复合体的形成和激活

真核生物冈崎片段的切除

1. RNase HⅠ 切开引物

2. FENⅠ 蛋白（具备 5’ -> 3’ 外切核酸酶活性）降解 RNA 引物片段

3. DNA 连接酶Ⅰ 连接冈崎片段

2.4.4 真核生物 DNA 聚合酶

• 已发现的有 15 种以上

• 哺乳动物细胞主要有五种：α、β、γ、δ、ε

• 真核细胞 DNA 聚合酶和细菌 DNA 聚合酶基本性质相同，均以 dNTP 为底物，需 $Mg^{2+}$ 激活，聚合时必须有模板链和具有 3’-OH 末端的引物链，链的延伸方向为 5’ -> 3’

2.4.5 端粒酶与 DNA 末端复制

• 末端复制问题end replication problem：由于所有新 DNA 合成启动都需要一条引物，这使得线性 DNA（后随链）末端的复制成为难题

• 以前导链为模板的复制不存在末端复制问题

• 解决末端复制问题

  1. 用蛋白质代替 RNA 作为每个染色体末端最后一个冈崎片段的引物

  2. （多数真核细胞）利用端粒酶来延伸染色体 3’ 端

• 端粒酶telomerase：一种特殊的酶，由蛋白质和 RNA 组成。与 DNA 聚合酶不同的是，它不需要外源 DNA 模板来指导新 dNTP 的添加。可利用自身含有的 RNA 成分作为模板将端粒序列添加到染色体 3’ 端

• 生殖细胞、干细胞、肿瘤细胞端粒酶活性高

2.4.6 DNA 复制的调控

• 真核细胞复制子水平调控决定复制的起始与否，高度保守